从抗体治疗转向基因治疗：单克隆抗体知识对腺相关病毒载体生物工艺的适用性
本文节选自《Making the move from antibody therapeutics to gene therapy：applicability of monoclonal antibody learnings to adeno-associated virus vector bioprocessing》，详细内容，请参考原文。
经过几十年的发展和学习，基因疗法成为了一个获得行业“爆炸性”兴趣的生物制药发展领域。美国食品和药物管理局(FDA)预测，基于目前的临床管线，到2025年，每年将批准10到20种新的细胞和基因疗法。一个最为流行的载体是腺相关病毒（AAV）载体，由于其具有低免疫原性且不整合到宿主细胞基因组的特性。AAV治疗于2017年首次获得美国监管部门批准，即被用于voretigene neparvovec (Luxturna®，Spark Therapeutics)治疗莱伯氏先天性黑蒙，之后是于2019年获得批准的onasemnogene abparvovec (Zolgensma®，诺华和AveXis)，用于治疗脊肌萎缩。近年来，AAV在基因治疗方面的应用显示出了巨大的潜力，在一系列的治疗应用中，有超过150项基于AAV的临床试验正在进行中。生产用于临床或商业用途的AAV是一个正在发展的领域，其采用多种方法，包括：瞬时转染，Sf9细胞杆状病毒感染，稳定的产生细胞系等。
相比之下，第一个单克隆抗体(mAb)治疗药物 - murromonab - CD3在1986年被批准用于治疗肾移植患者的类固醇耐药急性同种异体移植排斥反应：35年前的上一个世纪。FDA已经批准了来自40多家公司的100多种基于抗体的疗法。在过去7年(2014年1月至2020年11月)，总共有61个单克隆抗体产品获得批准，超过830个单克隆抗体正在临床试验中，其中88个处于III期临床试验。十多年来，商业抗体生物工艺通常符合已建立的生产平台，大多数抗体在CHO生产细胞系中表达，通过Protein A亲和层析和一到两个精制层析步骤来去除聚体形式以及工艺相关的杂质。虽然新型双特异性抗体需要对传统平台进行调整，但mAb领域的商品化和基因治疗的临床前景最近已经导致许多生物工艺科学家跨界投入基因治疗载体生物工艺行业。这些冒险者能给AAV领域带来哪些重要的“洞见”?成功的AAV载体生物工艺需要哪些额外的知识?
文本作者目前受雇于Regeneron，其从mAb和双特异性开发转向了AAV工艺的设计。尽管Regeneron Pharmaceuticals主要是作为抗体技术生物制药公司而被人所知，但最近它已经进入基因治疗领域。这一举措是通过内部开发以及与Intellia Therapeutics等公司的外部合作推动的。为此，在2020年4月大流行期间，Regeneron开设了一座新建的中试工厂和开发实验室，专门用于进行工艺和细胞系开发，以及AAV的临床前生产。
从35年的mAb开发中学到什么可以用来加速AAV生物工艺的开发?首先，这两个工艺利用了广泛相似的单元操作，包括生物反应器生产、直流和切向流过滤以及填充床低压层析。因此，一个精通mAb生产艺术的科学家关于单元操作的知识可以应用到AAV生产的相应生产步骤当中。此外，单克隆抗体生产行业在大规模生产方面具有丰富的经验，同时符合所有现行的良好生产规范(cGMP)，以满足生产供人使用药品的监管期望。由于工厂或工艺变化而需要的技术转移和可比性评估的最佳实践也在不断发展，其中许多方面是可转移的，可以告知基因治疗领域。
其次，自上世纪90年代以来，单克隆抗体的生产在生物工艺的一次性使用技术(SUT)方面处于领先地位。第一个一次性使用的生物反应器于1996年由Wave Biotechnology (现在的Cytiva) 推出，第一个一次性使用的搅拌罐生物反应器于2004年由Hyclone (现在的Thermo Fisher Scientific) 推出。与传统的不锈钢设备相比，这些新系统实现了批次和产品之间的快速周转时间，安装速度快，灵活性强，与清洗、灭菌和验证工作相关的所需资源更少。可以提高进入市场的速度，同时降低资本成本。一次性使用技术特别适用于AAV生产，因为批量更小，批次之间的周转时间更快，且出于无菌、交叉污染和操作人员安全性等考量，希望“分隔”工艺。这里，在mAb工艺中获得的关于SUT实施、局限性以及对控制溶出物和析出物的需要的知识非常适用于AAV工艺。
病毒污染的风险是所有基于人或动物来源细胞系的生物技术产品的共同特征。正如国际协调理事会(ICH)Q5A (R1)所讨论的，控制生物技术产品潜在病毒污染的三种主要的、补充性的方法已经形成：
细胞系、细胞库和原材料需针对避免外源性物质进行筛选；
产品需在生产的特性阶段进行检测，以确保没有感染传染性病毒；以及
由于不可能对所有病毒进行检测，因此生物制品的生产工艺必须设计为灭活或去除已知的感染源，这些感染源在产生产品时可能进入或在工艺流中传播，以及未知的、外源性病毒污染物
尽管AAV载体生物工艺的产品本身是一种病毒，但仍必须证明适当的清除和病毒安全控制。抗体生物工艺带来了针对所有三种方法的外源物安全管理的深入了解。就除病毒而言，与单克隆抗体一样，AAV下游工艺清除病毒的能力是通过加标研究来评估的，这些研究的设计和性能很容易从单克隆抗体转化为AAV生物工艺。
最后，虽然历史上的生物制品工艺开发往往强调通过良好控制的单变量实验来定义设定值和工艺条件，但mAb生物工艺开发的原则已经演变。现在，质量源于设计(QbD)的原则已被常规性地使用，以确保一个更系统的、以目标为中心的方法，通过多变量实验设计利用历史知识和结果，并在整个开发周期中使用质量风险管理。
在ICH Q8 (R2)指南中，QbD被定义为“一种系统的开发方法，它从预定义的目标开始，强调产品和工艺的理解和过程控制，基于健全的科学和质量风险管理”。已经发表的一些文章强调了在开发过程中通过设计而提高质量的好处。简而言之，QbD方法可以:
通过了解哪些质量属性是关键的，以及哪些工艺参数与这些属性最相关，来提高工艺的稳健性;
支持跨设施和规模的工艺转移，并减少这样做的监管负担;
提高控制策略，使产品更加一致;
简化生命周期管理;
通过减少高风险问题逃避监测的可能性，降低工艺所有阶段的失败可能性(尽管总是存在出现新的未知事物的风险)。
基于QbD的工艺开发示意图
图2显示了在QbD框架中开发工艺时可以使用的典型路线图。这些工具可以从mAb开发转移到基于预定义的关键质量属性目标、风险评估、多变量统计设计、过程建模和失败率分析以及基于知识的过程控制的耦合开发。总之，这种方法可以产生稳健且可靠的载体生物工艺，其中工艺参数和控制对质量属性的影响可被良好表征。
然而，病毒不是单克隆抗体，认为单抗生物工艺的所有方面都可以转移到一个新的领域是不现实的。那些正在走向基因治疗的人可以预见到哪些知识缺口呢?首先，单抗是一种大的蛋白质，是由4条多肽链组成的四聚体，大小约为10纳米(分子量≈150 kDa)，而AAV的直径约为20-25纳米，由不少于60个蛋白质组成，粒径是单克隆抗体的两倍。这些蛋白包覆着长度为4.7kb的基因组，总分子量为≈4.8 mDa。换句话说，一个AAV颗粒是一个mAb颗粒的两倍大，质量是mAb的32倍，由携带的病毒载体基因组所定义。此外，虽然典型的mAb工艺在工业补料分批生物反应器中预计可产生5-10 g/L滴度，但AAV工艺在收获时每升可获得1e14载体基因组(vg/L)，相当于0.8mg/L的病毒颗粒。因此，待处理的体积也会相应地不同：当2,000L补料分批生物反应器，以70%收率运行时，将会产生140L的药物底物，浓度50 g / L，同等规模AAV工艺以50%收率运行时，只会产生5 L的药物底物，典型浓度为2e13vg /mL (0.3 g/L)。这已经是假设这个工艺允许放大到2,000L；而在GMP车间，如果工艺涉及瞬时转染，可能还很难实现如此规模的放大。
实际上，这意味着单克隆抗体生物工艺的最佳实践和考量不一定能够转化。例如，尽管这两个工艺中的层析步骤最初看起来类似，但其限制性却非常不同。值得注意的是，生物反应器中较低的产物浓度意味着捕获柱体积在AAV的工艺设计中不是一个驱动性因素，而在一个合理的时间框架内快速捕获产物的能力更为重要。此外，具有更大的流体动力尺寸的AAV意味着现有的、扩散有限的层析基球可能不合适。这些考量都推动了理想的AAV层析固定相从填充床向膜和整体柱转变。考虑到上游工艺，mAb开发人员可能会发现，典型的生物反应器培养基和基于补液的方法可以最大限度地提高蛋白质产量和产物质量，这些参数包括蛋白质折叠、二硫键形成、糖基化，但在生产无二硫键的典型非糖基化DNA病毒(可能通过瞬时转染表达)时的作用有限。
掌握单克隆抗体艺术的科学家也可能发现自己在病毒学和分子生物学方面受到限制。AAV的DNA内部需要分子生物学分析技术，这对一个典型的mAb生物工艺科学家来说是不熟悉的。他们必须熟悉分子生物学技术、实践和细微差别，如引物/探针设计对数字液滴PCR的影响。这是必要的上游工艺，以提高最大化的DNA-以及蛋白质生产：通过正确的包装率。这种物质必须经过处理以保持病毒的传染性和效力。尽管这是一个丰富的学习旅程，但在为工艺开发团队配备人员时，招募具有广泛不同背景的人员是至关重要的，这样就不会忽视病毒生产的这些方面。
重点
基因治疗作为一种革命性的治疗方式，对其爆发性的关注导致了众多公司工艺开发和制造团队的增加。在mAb开发领域已有良好经验的生物工艺科学家被吸引到这个新的前沿生物工艺领域。他们可以带来宝贵的技能，包括:
相关的制造步骤知识；
cGMP、技术转移和可比性评估专业知识;
具有使用和开发一次性使用技术的经验;
熟知除病毒知识；以及
了解QbD和相关工艺开发知识。
然而，由于AAV载体更大的体积和质量、DNA组分的重要性、较低的生物工艺生产力以及必要的病毒知识，单靠mAb生物工艺工程师可能不足以保证在这个不断发展且迷人的领域取得成功。
原文：Andrew D Tustian, Making the move from antibody therapeutics to gene therapy：applicability of monoclonal antibody learnings to adeno-associated virus vector bioprocessing, Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 359–365.
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